第六节 细菌的生化试验（实验课上）
第七节 细菌的生物被膜（新的概念）
1.概念→对微生物有利
细菌生物被膜（bF）是指细菌粘附于接触表面，分泌多糖基质，纤维蛋白，脂质蛋白等将其自身绕其中而形成的大量细菌聚集膜样物。多糖基质通常是指多糖蛋白复合物，也包括周边沉淀的有机物和无机物等。
注：生物被膜和生物膜区别
2.特征
1是细菌的一种最有保护性的生长模式，是细胞间相互协调作用的复杂的多细胞群体，具有结构和代谢复杂化。形成生物被膜的黏附细菌群也可以释放出生长迅速的浮游细菌，是潜在的“菌巢”。
2生长于 bF 中的细菌，无论其形态结构、生理生化特性及对菌药物的敏感性都与浮游量长的细胞显着不同，致病特点也不同。
3.形成机制
3.1 条件膜的沉积
主要涉及体液中各种糖蛋白，粘多糖，金属离子的吸附。
3.2 细菌的初始到达及吸附
3.3 细菌的生长繁殖
指细菌的吸附，生长繁殖及扩散。
3.4 生物被膜的形成
细菌程序性的表达并分泌 EpS 不断形成微菌落成熟的生物被膜的过程。
3.5 细菌的分散及持续性感染
第三章 消毒与灭菌（对象→微生物，灭菌→灭细菌及其他病原）
1.概念
1.1 杀菌作用：指某些物质或因素具有在一定条件下杀死微生物的作用。
1.2 抑菌作用：指某些物质或因素具有抑制微生物生长与繁殖的作用。
1.3 抗菌作用：指某些药物所具有的抑制或杀灭微生物作用（与浓度有关）。
1.4 灭菌作用：杀灭物体中所有病原微生物和非病原微生物及其芽孢、霉菌孢子的方法。
1.5 消毒：指杀灭物体中的病原微生物的方法，消毒只要求达到消除传染性目的，而对非病原微生物及其芽孢，孢子并不严格要求全部杀死。
1.6 防腐：指阻止或抑制微生物生长繁殖方法（盐巴，糖→高渗→防腐）
1.7 无菌：指没有微生物状态。采取防止或杜绝任何微生物进入物体或其它物体的方法，称为无菌法，用于防止微生物进入动物组织或其他无菌操作技术称为无菌技术或无菌操作。
2.常用的消毒方法（巴氏消毒→属于高温）
2.1 物理方法
弱杀伤类 如冷冻、干燥、可见光等
强杀伤类 如热力、紫外线、超声波等
机械除菌 如冲洗、过滤等
2.2 化学方法
使蛋白质变性或凝固 如：醛类消毒剂
损伤细胞 如：表面活性剂
干扰细菌的酶系统和代谢 如：某些氧化剂、重金属盐等
改变核酸功能 如：染料，烷代剂
2.3 生物方法：抗生素、植物杀菌素、细菌素、噬菌体
第二节 物理灭菌消毒方法
1.热力灭菌法
1机制：高温可破坏菌体蛋白质，核酸，酶系统，导致菌体死亡
→高温最常用于消毒和灭菌
2大多数细菌，酵母菌，霉菌等繁殖体和病毒在 50~60c，10min 可杀死
讲到各论时基本均以 56c为准
3芽孢 121c，5~20min 方能杀死
4同种微生物老龄菌比幼龄菌耐热
煎，炒，煮
热力灭菌法：
?火焰灭菌：
焚烧灭菌、灼烧灭菌→酒精喷灯
干热灭菌 热空气灭菌（烘烤灭菌）←烤箱
红外线灭菌
?湿热灭菌：
煮沸
巴氏
流通蒸汽消毒法
流通蒸汽灭菌法（间歇灭菌法）
高压蒸汽法
1.1.1 火焰灭菌
1.1.1.1 焚烧法
1方法：直接点燃或在焚烧炉内焚烧
2适用范围：动物尸体，病畜禽的热料，废弃物品
3优点：高温分解和深度氧化综合处理且彻底
4缺点：投资大，排烟引起二次污染
1.1.1.2 灼烧
1方法：直接用火焰灭菌
2适用范围：接种环（针）试管中金属器皿等灭菌
1.1.2 热空气灭菌（干烤法）
1方法：将物品置于干热灭菌箱内，缓慢加热空气至 160~170c，维持 1~2h。
2适用范围：高温下不变质，不损坏不蒸发物品，如玻璃器皿，金属器械。
3注意事项：待干热灭菌的物品，不能太挤干热灭后，干热灭菌箱的温度要降至 60~70c时才开箱门。
考：怎么做灭菌，注意事项
1.1.3 红外线灭菌
1原理：远红外线波长为 0.77~1000um 电磁波，它以辐射方式向外传播，热效应好，可达到 120c左右的高温，且特别易被生物体如各种病菌吸收，远红外线消毒方式是采用石英电热管产生 120c以上。
高温来消毒
2特点：速度快，效率高，穿透力强
3适用范围：医疗器械及日常生活中常用的器皿，食具等
1.1.4 巴氏消毒法
1特点：用较低温度杀灭液体中的病原微生物或特定微生物，而仍保持物品中所需的不耐热成分不被破坏的消毒方法。
2适用范围：半乳制品，酒类等消毒
3方法（1）低温维持巴氏消毒法 Lth ：63~65c，30min
（2）高温瞬时巴氏消毒法 htSt：71~72c，15~30s
（3）超高温巴氏消毒法 Uht : 132c,1~2s 迅速冷却至 10c
（冷击法）→工业化
1.1.5 煮沸
1特点：煮沸 10~20min 可杀死所有细菌繁殖体，芽孢常需煮沸 1~3h才被杀死。若水中加入 2%的 Na2co3或石炭酸，可提高沸点至 105c，既可加速芽孢的死亡，又能防止金属器械生锈
猪栏，1 栏换 1 个针头→防止感染
2适用范围：手术器械，注射器，针头及食具等。
影响因素：海拔高度
1.1.6 流通蒸汽消毒法
1特点：101.3kpa（1 个大气压）100c（气浴），15~30min可杀死细菌的繁殖体，但不能杀死芽孢和孢子。
2适用范围：常用于不耐高温的营养物品，如含糖或含血清培养基灭菌
1.1.7 流通蒸汽灭菌法
1特点：利用流通蒸汽杀灭细菌繁殖体和保温促芽孢出芽交替进行，达到完全灭菌目的。
2方法：100c维持 30min，37c温箱过夜，连续进行 3 次灭菌和 2 次保温不耐高温的培养基的，70~80c维持 1h，37c温箱过夜，连续进行 3 次灭菌和 2 次保温。
3适用范围：用于不耐高温的培养基灭菌
1.1.8 高压蒸汽灭菌法
1特点：利用高压蒸汽灭菌器进行的灭菌方法→应用最广、最有效的灭菌方法
2方法：常用 103.4kpa 的压力，在 121.3c温度下维持15~20min 即可杀死所有微生物，达到完全灭菌目的实验室必须做的→加蒸馏水→自来水含氯腐蚀电子控件。
3适用范围：耐高温，不怕潮湿，物品的灭菌，如培养基，溶液，器皿器械，工作服的实验动物尸体等灭菌。
4注意事项：
（1）灭菌不宜过大，过紧，灭菌器内物品放着含量不应超过灭菌器柜容积的 85%。
（2）盛装物品的容器应有孔，若无，孔应将容器盖打开。
（3）布类物品放在金属，糖瓷类物品上。
（4）灭菌锅密闭前，应将冷空气充分排空（一直强调）
（5）随时观察压力及温度情况
（6）注意安全操作，每次灭菌前，应检查灭菌器。
（7）灭菌完毕后减压不要过猛，压力表回归，“0”位后才可打开盖或门。
（8）被灭菌物品应待干燥后才能取出各用。
5在同一温度条件湿热灭菌比干热灭菌效力大。
原因：
（1）热蒸汽对细胞成分的破坏更强小分子的存在有助于破坏维持蛋白质二维结构的氢键和其它相互作用弱键，更易使蛋白质变性。蛋白质含水量与其凝固温度成反比。
（2）热蒸汽比热空气穿透力强能更加有效地杀灭微生物。
（3）蒸汽存在潜热
当气体转变为液体时可放出大量热量，故可迅速提高灭菌物体的温度。
2.辐射灭菌法
?电离辐射：
放射性同位素射线aβγ
x 射线等
非电离辐射
可见光，日光
紫外线，红外线
微波等
2.1 可见光
1指在红外线和紫外线之间，肉眼可见的光线，波长 100~800nm，可见光只有微弱的杀菌作用。
2光感作用：染料加到培养基或涂在外伤表面，增强可见光杀菌作用的现象。
2.2 阳光
直射日光有强烈的杀菌作用，是天然杀菌因素，紫外线是日光杀菌作用主要因素。
2.3 紫外线杀菌
1波长 200~300nm 的紫外线有杀菌作用，其中以 265~266nm 最强。
2杀菌机制：使同一条 dNA 链上相邻的胸腺嘧啶（t）生产共价键形成二聚体，干扰 dNA 的复制与转录。
3杀菌特点：穿透力弱，只是表面消毒
4适用范围：手术室，传染病房，细菌实验室的空气消毒或不耐热物品表面消毒。
5光复活作用 →光裂解酶
2.4 电离辐射
1又称冷消毒，冷灭菌。是利用放射性同位素的射线或电子辐射，穿透物品，杀死一切微生物的方法。
2特点：
（1）x 射线不如紫外线，作用慢。波长愈短，杀菌能力愈强。
（2）aβ射线电离电离辐射作用强，γ射线较弱。
（3）βγ射线穿透力强
3主要应用于灭菌的射线有 x 射线，β射线，γ射线。
4机制：产生游离 h+和 oh-，其为强烈还原剂和氧化剂，直接作用细菌本身，导致包括 dNA 在内的细胞内部物质分解，使细菌死亡或发生突变。
5优点：
（1）穿透力强，消毒均匀彻底，效果可靠，不受包装形式限制。
（2）不会使物品升温，适用于不耐热物品灭菌。
（3）节省能源
6缺点：一次性投资大，还需经过特殊训练的专门技术人员进行管理。
7应用范围：精密医疗器械，一次性医疗用品（注射器、输液器、输血器等）药物，食品，工业产品，生物医学制品等。
2.5 微波
1特点：从几百兆 hz 至几十万兆 hz 频率的无线电波称为微波。
2方法：主要是利用微波的加热作用完成灭菌且必须在一定含水量条件下才能显示出来，需时短，加热均匀。
3用途：可用于非金属医药用品等的灭菌加热金属时会产生火花击穿配件。
3.干燥和渗透压
1特点：微生物在失去大量水分时，新陈代谢障碍，菌体蛋白质变性，逐渐死亡。
2用途：用干燥法来保存食品，饲料，谷类，皮张，药材等
利用高浓度的盐水或糖水保存食品
3方法：干燥法创造干燥环境
高渗溶液吸收菌体水分，造成生理干燥而抑菌
4.滤过除菌
1概念：通过机械阻留作用将液体或空气中细菌等微生物除去的方法。
2用途：
（1）液体培养基和药物除菌
（2）病毒液分离除菌
（3）空气净化除菌
3注意事项
超速离心才能过滤病毒